ADC载荷梳理系列(1)：甾体类化合物

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作者｜知乎_西山含黛

近年来，随着多款抗体-药物偶联物(ADC)的批准以及多个ADC实体在临床开发中取得可喜进展，人们对ADC的研发兴趣大增^[1]。通过将生物活性分子(Payload)连接到具有靶向性的抗体，ADC可将Payload靶向递送至与疾病相关的细胞/组织，同时最大限度地减少其在全身的分布，降低毒副作用，提高Payload的治疗窗口^[2]。

基于ADC的作用优势，ADC技术在除肿瘤以外的许多其他疾病领域都有潜在的应用，并且这种应用扩展的例子越来越频繁地出现在科学文献及专利中。

甾(zai)体类药物(Steroid)，分子母体结构中都含有环戊烷骈多氢菲（cyclopentano-perhydrophenanthrene）碳骨架，此骨架又称甾核（steroid nucleus），通常用于治疗与多种疾病相关的炎症。然而，这些药物也会引起肌肉骨骼、内分泌和胃肠道副作用以及其他毒性，限制它们的治疗效用(尤其是长期服用时)。基于以上甾体类药物的使用情况，将甾体类药物引入到抗体中构建新型ADC，作用于目的免疫细胞，以此减少全身性副作用同时保持甾体类药物的抗炎活性，成为一大潜力研究领域^[3]。      

图注：甾体类化合物

接下来，作者将梳理近年来利用甾体类药物构建ADC的部分文章/专利，供大家参考学习。

  01  

早期甾类化合物ADC构建--Dexa-Ab_hEsel

追述到2002年，格罗宁根大学药物探索研究所Maaike Everts博士较早利用糖皮质激素(Glucocorticoid)构建ADC^{[4, 5]}。在慢性炎症性疾病中，内皮细胞在白细胞募集中起着重要作用，因此其成为药物干预的一个极具吸引力的靶点，抑制内皮细胞活化和随之而来的白细胞浸润可改善慢性炎症性疾病的治疗效果。Maaike Everts博士以靶向E-选择素(E-selectin)的抗体与地塞米松(Dexamethasone)构建Dexa-Ab_hEsel (羧基+伯胺随机偶联^[6]，DAR=2.3)，可选择性地与TNF-α刺激的内皮细胞结合，而不与静息态的内皮细胞结合；Dexa-Ab_hEsel经过细胞内吞在溶酶体内降解后，酯键水解释放出具有药理学活性的Dexa，能够下调促炎基因IL-8的表达(图1)。该项研究表明使用Dexa-Ab_hEsel可选择性地将抗炎药物递送到活化的内皮细胞中，为后续药物开发提供指导。

图1. Dexa-Ab_hEsel的构建及其对促炎基因IL-8的影响

  02  

丹麦Cytoguide公司--Anti-CD163-Dexa ADC

除了E-Selectin外，CD-163 (Hemoglobin Scavenger Receptor，血红蛋白清道夫受体)靶点也被用来开发含Glucocorticoid的ADC。2012年，丹麦Cytoguide公司开发出一种新的可生物降解的靶向CD163的ADC，可特异性地将Dexa靶向递送至巨噬细胞中的CD163 (图2)^[7]。在Dexa末端21位-OH上引入琥珀酸形成Dexa-hemisuccinate，对其末端羧基进行活化引入NHS酯构建Drug-Linker：Dexa-hemisuccinate-NHS，提高后续偶联效率；将其与抗体室温孵育(pH 8.3, PBS, ~15 Min)，与伯胺进行随机偶联(主要是赖氨酸)，所构建的ADC-Anti-CD163-Dexa的DAR值为4 (图2左)，偶联后对CD163表现出高亲和力，说明该种随机偶联的方式对其亲和力没有过多的影响。体外研究和体内研究表明，Anti-CD163-Dexa具有很强的抗炎作用，可使脂多糖诱导的肿瘤坏死因子分泌减少(图2中、右)。Anti-CD163-Dexa中地塞米松的效力是非偶联地塞米松的~50倍。与地塞米松的强烈全身作用相反，等效剂量的Anti-CD163-Dexa没有这些副作用：胸腺淋巴细胞凋亡、体重减轻和内源性皮质醇水平的抑制。综上所述，该研究表明ADC是抗炎巨噬细胞定向治疗的未来方法。同时也说明CD163是抗炎药物递送的极佳靶点。

图2. ADC-Anti-CD163-Dexa的构建及其抗炎活性的评价

  03  

Merck联合Ambrx，基于新型焦磷酸二酯Linker开发系列ADC

为探究ADC在肿瘤学适应症之外的应用，Merck和Ambrx公司强强联合，发现了一种新型焦磷酸二酯Linker。作为小分子，含有该种焦磷酸二酯的Drug-Linker具有很好的水溶性、出色的血浆稳定性以及在溶酶体环境中快速释放有效载荷等特点，可实现Glucocorticoid的靶向递送(图3)^[8]，因此利用该种新型Linker开发了一系列靶向CD70^[8-10]和CD74^[11]的新型ADC药物。 

图3. 含有焦磷酸二酯ADC的作用机制

Merck & Ambrx公司研究人员于2016年在JACS上公布了利用新型焦磷酸二酯Linker构建位点特异性ADC的方法^[8]；同年，在Biocojugate Chemistry上发文对焦磷酸二酯Linker进行优化，引入组织蛋白酶B (Cathepsin B, CatB)敏感的VC二肽接头^[9]；针对以上研究内容分别于2015年和2017年公布了关于该类型ADC的专利-WO2015153401^[12]和WO2017062271^{[13, 14]}；2018年，两家公司的研究人员又在Biocojugate Chemistry上发文优化焦磷酸二酯Linker，构建新型ADC^[11]。

接下作者将简要介绍该系列ADC的构建工作。

CD70^[15]是一种在免疫细胞中特异性表达的受体，同时也在多种人类癌症中异常表达。目前针对该靶点ADC药物的开发多集中于肿瘤学领域^[16]，但针对免疫细胞进行ADC的开发较少。基于CD70在肿瘤ADC文献中作为靶点的先例，以其相对应的抗体做为模式抗体进行概念验证，引入Glucocorticoid并测试特定细胞系对Glucocorticoid的反应情况。

Merck & Ambrx公司研究人员以anti-hCD70抗体-2h5^[17]进行模式反应，利用基因密码子扩增技术^[18]将非天然氨基酸(para-azido-phenylalanine, pAF^[19])引入到2h5抗体CH1 (HA114)中，替换原有的丙氨酸，使其与含有环辛炔结构的Linker-Drug发生无铜催化的叠氮炔基环加成反应^[20]构建含有Dexa的系列ADC (图4)，其DAR值均大于1.8；同时也显示出高单体含量(>98%)，并且发现纯化后残留的Linker-Drug小于1%。

图4. 无铜催化的SPAAC构建含有糖皮质激素的ADC

Drug涉及地塞米松、布地奈德和氟替卡松。对于地塞米松和布地奈德而言，其与Linker连接的位点为21位；对于氟替卡松而言，其与Linker连接的位点为11位的羟基，且二者中间还存在亚甲基(1-37)，在无亚甲基存在的情况下，所构建的ADC (1-33)无法将所带药物完全转化为Free的形式释放，怀疑是11位空间位阻所致。通过上述两种ADC简单代谢过程的研究认为该类ADC发挥作用机制涉及两种酶：一种用于切割焦磷酸二酯键(例如磷酸酶)，另一种用于水解剩余的末端磷酸集团并释放free形式的药物。对于含有不同磷酸基团的Linker-Drug，含有单磷酸的在溶酶体裂解液中缓慢释放药物，含有双磷酸的在溶酶体裂解液中快速释放药物；因此，在后续ADC研究主要以不含苯环的焦磷酸二酯Linker作为主要的研究对象。

GILZ (Glucocorticoid-Induced Leucine Zipper) mRNA表达水平是糖皮质激素受体(Glucocorticoid Receptor, GR)富集的主要指征，多用于糖皮质激素对受体刺激程度的表征，在此利用该参数来评估所构建ADC的活性。利用含不同数目磷酸基团的ADC处理CD70⁺ 786-O细胞，含有焦磷酸二酯结构的ADC的活性强于含有单磷酸的ADC，说明该类ADC在细胞中的活性与其在溶酶体中的裂解能力有关(图5左上)；利用该方法构建的ADC处理CD70⁺ 786-O细胞，1-37与氟替卡松丙酸脂作用相当，1-33因无法释放游离的药物而完全无活性(图5左下)，以上数据说明该类型ADC的作用依赖于其Linker-Drug的构成。相较于对照组ADC (α-RSV)，实验组ADC (α-hCD70, 除1-33外)均表现良好的细胞活性(图5右)。

图5. 该类型ADC的细胞活性：α-hCD70(实验组)和α-RSV (对照组)

针对此类型ADC中所用Linker发挥药效的作用机制JACS仅给出了推测，并未进行详细的研究。为了能够更广泛应用此类Linker，Merck & Ambrx科研人员对其进行优化，开发了一款新型焦磷酸二酯桥接的CatB敏感的Linker，用以实现糖皮质激素的靶向递送^[9]。该种Linker含有缬氨酸-瓜氨酸(Valine-Citrulline, VC)结构，用于CatB的特异性识别；同时，该Linker还含有自降解的PAB结构。该种ADC进入体内经CatB裂解和PAB自发丢失后，将产生含有单磷酸的布地奈德，然后末端磷酸可以被磷酸酶裂解以释放游离的布地奈德(图6上)。这种Linker-Drug设计策略以溶解度增强的方式掺入CatB敏感的二肽和糖皮质激素类固醇，在确保高DAR值的同时减少疏水性导致的聚集问题。与JACS中ADC的构建方法一致，将构建好的两种ADCs (aCD70-8a/b)处理CD70⁺ 786-O细胞，利用RT-qPCR测量GILZ mRNA表达水平以评估该类型ADC活性，实验结果表明aCD70-8a/b可使GILZ mRNA表达水平以剂量依赖性的方式显著表达，且EC₅₀值与布地奈德相似(图6下)。相较于对照ADC (aRSV)，aCD70-8a/b可实现靶向递送，活性作用与Linker-Drug在溶酶体环境中被切割的能力相关。

图6. 含有布地奈德载荷ADC的构建及其载荷释放机制

基于上述Linker-Drug的技术优势，Merck & Ambrx公司于2015公布专利-WO2015153401^[12]，2017年公布专利-WO2017062271^[13]。作者对两篇专利中所提及的内容进行简单梳理(表1)，供大家参考学习，具体内容请参考专利。

表1. 专利WO2015153401和WO2017062271内容的简单梳理

两篇专利关于所构建ADC的活性评价方式与前述文献中记载的一致。两篇专利的内容大致相似，WO2015153401的首次公开日为2015年10月8日，WO2017062271优先权日为2015年10月6日，因此WO2015153401不能作为现有技术评价WO2017062271的创造性。

除了上述提及的Drug外，2018年Merck & Ambrx公司研究人员利用氟替卡松丙酸酯(Fluticasone Propionate)作为有效载荷构建靶向CD74的ADC (图7)^[11]。对Anti-CD74-flu449作用机制研究表明，组织培养上清液中游离有效载荷的积累是活性的主要驱动因素；此外，将该ADC施用于人CD74转基因小鼠未能激活脾脏B细胞中的糖皮质激素受体靶基因，研究人员认为产生这种现象的主要原因是有效载荷的渗透性。基于以上事实，设计合成大量的氟替卡松丙酸酯衍生物评估其在不同pH条件下的渗透性，确保Drug在中性pH有较低的渗透性，在pH5-6时拥有适中的渗透性使其可以从溶酶体中逃逸出来，最终选取Compound A构建新型ADC：anti-CD74-AXC496。

虽然anti-CD74-AXC496的活性没有Anti-CD74-flu449优秀，但作者更倾向于其产生的细胞特异性靶向递送，为降低该类型药物的毒副作用提供帮助。Anti-CD74-AXC496 (DAR=1.5)的活性低于Anti-CD74-flu449 (DAR=1.9)也有可能是其DAR较低的原因，后续若作者再提高其DAR值可能会消除这种活性较低的问题。 

图7. 构建抗CD74 ADC靶向递送糖皮质激素及其活性评价

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 主要参考文献 

1. Fuentes-Antrás, J., et al., Antibody-drug conjugates: in search of partners of choice. Trends Cancer, 2023. 9(4): p. 339-354.2. Fu, Z., et al., Antibody drug conjugate: the "biological missile" for targeted cancer therapy. Signal Transduct Target Ther, 2022. 7(1): p. 93.3. Dragovich, P.S., Antibody-Drug Conjugates for Immunology. J Med Chem, 2022. 65(6): p. 4496-4499.4. Everts, M., et al., Selective intracellular delivery of dexamethasone into activated endothelial cells using an E-selectin-directed immunoconjugate. J Immunol, 2002. 168(2): p. 883-9.5. Ásgeirsdóttir, S.A., et al., Delivery of pharmacologically active dexamethasone into activated endothelial cells by dexamethasone–anti-E-selectin immunoconjugate. Biochemical Pharmacology, 2003. 65(10): p. 1729-1739.6. Melgert, B.N., et al., Dexamethasone coupled to albumin is selectively taken up by rat nonparenchymal liver cells and attenuates LPS-induced activation of hepatic cells. J Hepatol, 2000. 32(4): p. 603-11.7. Graversen, J.H., et al., Targeting the hemoglobin scavenger receptor CD163 in macrophages highly increases the anti-inflammatory potency of dexamethasone. Mol Ther, 2012. 20(8): p. 1550-8.8. Kern, J.C., et al., Discovery of Pyrophosphate Diesters as Tunable, Soluble, and Bioorthogonal Linkers for Site-Specific Antibody-Drug Conjugates. J Am Chem Soc, 2016. 138(4): p. 1430-45.9. Kern, J.C., et al., Novel Phosphate Modified Cathepsin B Linkers: Improving Aqueous Solubility and Enhancing Payload Scope of ADCs. Bioconjug Chem, 2016. 27(9): p. 2081-8.10. Beaumont, M., et al., Antibody-drug conjugates: integrated bioanalytical and biodisposition assessments in lead optimization and selection. AAPS Open, 2018. 4(1): p. 6.11. Brandish, P.E., et al., Development of Anti-CD74 Antibody-Drug Conjugates to Target Glucocorticoids to Immune Cells. Bioconjug Chem, 2018. 29(7): p. 2357-2369.12. Garbaccio, R.M., et al., Preparation of phosphate based linkers for intracellular delivery of drug conjugates. 2015, Merck Sharp & Dohme Corp.Ambrx, Inc.13. Brandish, P.E., et al., Antibody drug conjugate for anti-inflammatory applications. 2017, Merck Sharp & Dohme Corp.Ambrx, Inc.14. Rosse, G., Antibody-Drug Conjugates for the Treatment of Inflammation. ACS Med Chem Lett, 2017. 8(10): p. 992-994.15. Flieswasser, T., et al., The CD70-CD27 axis in oncology: the new kids on the block. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 2022. 41(1): p. 12.16. Shiomi, M., et al., CD70 antibody-drug conjugate: A potential novel therapeutic agent for ovarian cancer. Cancer Sci, 2021. 112(9): p. 3655-3668.17. Adam, P.J., et al., CD70 (TNFSF7) is expressed at high prevalence in renal cell carcinomas and is rapidly internalised on antibody binding. Br J Cancer, 2006. 95(3): p. 298-306.18. Manandhar, M., E. Chun, and F.E. Romesberg, Genetic Code Expansion: Inception, Development, Commercialization. J Am Chem Soc, 2021. 143(13): p. 4859-4878.19. Arranz-Gibert, P., et al., Chemoselective restoration of para-azido-phenylalanine at multiple sites in proteins. Cell Chem Biol, 2022. 29(6): p. 1046-1052.e4.20. Agard, N.J., J.A. Prescher, and C.R. Bertozzi, A strain-promoted [3 + 2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems. J Am Chem Soc, 2004. 126(46): p. 15046-7.

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